제주흑우의 대량 증식 기술 개발 및 산업화
<제주대 학교 산학협력단>
Ⅰ. 제 목
제주흑우의 대량 증식 기술 개발 및 산업화
Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성
연구개발의 목적 및 필요성은 멸종위기 제주흑우를 첨단 생명공학 기술로 대량 번식 시키는데 있음. 제주흑우는 한우 4 품종 중의 한 종으로 세계자연유산 제주특별자치도에서만 서식하고 있음. 고려 왕조시대 이래 임금님의 진상품으로 촘촘한 마아블링과 유연성 및 질감이 있고 불포화지방산인 올레익산과 리놀레익산이 풍부하여 웰빙식품으로도 최근에 관심을 끔. 따라서 1990년대 초반부터 제주흑우 보존프로그램 하에 멸종동물로 간주되어 보호돼 오고 있음. 이런 관점에서 생명공학기법을 이용한 대량증식은 고급브랜드육 생산으로 이어져 한·미 FTA타결로 침체된 농가의 위기극복 뿐만 아니라 국제적으로 경쟁력 있는 상품을 생산하여 국가에 일익이 될 것임.
Ⅲ. 연구개발 내용 및 범위
연구개발 내용 및 범위는 i) 체내·외 수정란 생산 및 이식기술 개발 ii) 생식세포 (정자와난자) 성 감별 iii) 수정란 동결기술 최적화 iv) 제주흑우유전 형질 탐색 및 v) 우량 제주흑우보존과 관련 보조생식기술 개발임.
Ⅳ. 연구개발결과
연구개발로서 얻어진 결과는 다음과 같음. i) 제주흑우 친자감별 및 등록에 필요한 24개 마커를 선정하고 활용함. ii) 2013년 현재, 제주흑우 등록우 460두, 등록대기 150두로 연구시작 2008년 96두에서 610두로의 증식효과에 기여함. iii) 우수 흑우정액 선별을 위한 데이터베이스 구축용 정액분석기와 정액스트로제조 자동화 시스템을 두 기관 (제주도 축산진흥원과 국립축산과학원 난지축산시험장) 내에 설비하여 가동되게 함. iv) 체외수정란 생산 효율을 높인 새로운 수정기법과 배양기술 개발하여 3건 특허 등록함. v) 본 연구진에의해 개발된 초자화동결기술은 농장에서 one-step 융해 후 바로 이식하는 동결방법임. vi) 현존하거나 죽은 우량 제주흑우 종모우 (복제씨수소‘흑영돌이’, 현존하는 체세포이용; ‘흑올돌이’, 죽은 씨수소 체세포 동결 2년 뒤 녹여 이용) 체세포와 종빈우 (‘흑우순이’, 죽은 씨암소 체세포 동결 2년 뒤 녹여 만든 복제수정란을 초자화동결기술로 세계처음으로 복제성공) 체세포 확보 후 체세포 핵이식기법으로 복제씨수소 2두와 씨암소 1두를 생산함. vii) 복제소 성과 (3두) 와 논문 성과 (19편) 을 언론 매체를 통해 홍보함 (총 257건). viii) 2010년 농림수산식품 우수과제 선정 및 일본 동물생식학회 (JRD) 우수논문으로 선정됨. ix) 제주흑우 천연기념물 제546호 지정에 기여함. x) 관련기술을 교육·홍보 (20건) 하고 우수인력을 양성함 (5건; 석사 5명).
Ⅴ. 연구 성과 활용계획
연구 성과 활용계획은 다음과 같음. i) 확립된 유전자 marker 체계를 활용한 친자감별확인과 도체 형질분석 통한 우수유전능력 제주흑우 발굴. ii) 제주흑우 전용 홈페이지를 통한 제주흑우 전수 공개로 소비자 니즈 충족. iii) 구축된 기반·설비를 이용한 수정란이식사업의 활성화유도. iv) 제주흑우 대량증식을 통한 제주흑우 판매유통 산업화 기반 활성화. v) 제주흑우 천연기념물 제546호 지정에 따른 제주특별자치도와 제주대학교 줄기세포연구센터 간“우량 제주흑우 체외수정란 이식사업협약”으로 활성화
제1절 연구개발의 목적
¡ 세계적인 자유무역주의의 확산에 따라 국내 농축산물 시장도 완전히 열린 시장으로 이행하게 될 것임(대외경제연구원,FTA대응전략연구,2008년).WTO/DDA 농업협상에 따라 2020년 이전에 개도국 수준의 관세감축을 종료하게 될 것이며,이후에는 선진국 수준의 의무를 담당하게 될 것으로 전망됨.
¡ 한․미 FTA 체결이 이루어져 경쟁력이 심화되고 있는 가운데 국내산 쇠고기의 가격은 주수입국인 미국에 비해 4.1배나 비싸 가격 경쟁력이 미약한 현실임.
¡ 최근 국민소득의 증가로 육류의 소비가 증가하고 있으며 고급육에 대한 수요도 증가하는 실정이며,우리 국민의 기호를 충족시킬 뿐만 아니라 외국산 쇠고기와 경쟁력을 갖출 수 있는 고유 한우의 품종개발과 특성화 및 브랜드화가 필요함.
¡ 한우 사육농가 및 쇠고기 시장보호를 위해 국제 경쟁력을 갖춘 고품질 한우의 대량 생산이 시급한 실정임.이러한 의미에서 한우가 경쟁력을 갖는데 중요한 요소인 “고유한,차별화된 맛”을 지니는 고유 전통의 한우인 제주흑우 품종 개발은 축산농가의 소득 및 수입육에 대한 한우육의 국제경쟁력을 개선할 수 있는 계기가 될 것임.
¡ 제주흑우는 갈색한우와는 달리 육질이 아주 단백하고 특별한 맛을 가지고 있어 임금님에게 진상품으로 공출되었으나,잦은 공출과 일제시기의 멸종정책으로 현재 겨우 제주에 370여마리(친자감별을 통한 유전자원 등록이전)로 그 명맥이 유지되고 있는 실정임.
¡ 따라서 멸종위기에 있는 제주흑우를 수정란 이식 기술에 의해 대량 번식시키고,첨단 생명공학기술인 핵이식 기법에 의해 복제 생산함으로써 그 품종을 유지 시키고 나아가 고품질 브랜드육 대량생산 체계를 갖춰 국제 경쟁력 있는 상품으로 개발하는데 목적을 둠.
¡ 더불어 세계 7개 자연경관인 제주특별자치도에만 존재하는 멸종 위기 제주흑우의 우량 유전자원 보존,등록 및 연구성과 보고 등을 통해 지속적으로 그 의미와 중요성을 알려 제주흑우는 우리가 보존하고 관리해야 할 유산임을 알리고자 함.
제2절 연구개발의 필요성
¡ 2030년까지 1인당 국민소득(GNI)4∼5만 달러로 증가하면서 고소득 시대를 살아가는 생활양식과 국민의식의 전환이 뚜렷해질 것임(대외경제연구원).고소득 시대에 따른 농산물 소비의 다양화로 제품차별화가 가속화되고,외식 산업의 지속적인 성장이 예상됨.
¡ 농산물의 신 수요와 신 시장이 지속적으로 확대․정착될 것임.소득증대에 따라 소비자의 의식변화가 급진전되면서 소비선택기준에 근본적인 변화가 진행 중에 있음.가격,양,모양중심에서 안전성,품질,편의성,건강성,기능성,나아가 감성이 농식품 소비에서 소비자 선택의 중요한 기준이 되고 있음.
¡ 최근 국민소득의 증가로 육류의 소비가 증가하고 있으며 고급육에 대한 수요도도 증가하는 실정임.그래서 우리 국민의 기호도를 충족시킬 뿐만 아니라 외국산 쇠고기와 경쟁력을 갖출 수 있는 우리 고유 한우의 품종개발과 특성화 및 브랜드화가 필요함.
¡ 제주흑우는 갈색한우와는 달리 육질이 아주 단백하고 고기맛 (특히 상강육이 발달)이 우수하여 고려시대 및 이조시대 삼명일 (임금님생신날,동지,정원초하루)에 정규진상품으로 공출 되었음.
¡ 제주흑우는 세계 7대 자연 경관인 제주의 청정 이미지를 기초로 안전성,품질면에서 국내의 다른 축산물은 물론 세계의 그 어떤 축산물과도 확실히 차별화되어 있어 국내 소비자는 물론 전 세계인이 없어서 먹지 못하는,한번 먹어보는 것이 소원인 최고의 농산물로 개발이 가능함.
¡ 제주흑우는 도외 반출이 엄격히 제한되고 있으며 위생안전에 민감한 소비자의 심리에 긍정적으로 작용할 수 있는 가축전염병 청정지대 (Freezone)제주에서 생산 되는 국내 유일의 품종임.
¡ 이런 관점에서 대량증식 기반만 마련된다면 제주흑우는 국제 경쟁력 있는 상품으로 개발 가능함.
¡ 따라서 제주흑우 (그림 1)의 품종개발과 특성화 및 브랜드화는 매우 시의 적절함.
그림 1. 제주 축산진흥원에서 보유하고 있는 제주흑우 씨숫소(♂, 왼쪽, 시가 2억 호가) 와 암소 (♀, 오른쪽)
¡ 제주흑우는 등심내의 Marbling이 한우 등심보다 가늘면서 촘촘하게 박혀있고,고기의 탄력성 및 먹었을 경우 씹은 후 은은하게 퍼지는 달콤한 향기가 일품이며,도축 후 등급 판정 결과 1등급이상이 84.6% (한우,66.2%)이었으며,뒷다리부분까지 Marbling이 우수함 (표 1과 2,그림2참조).
¡ 제주흑우는 일본 소 화우 (와규)에 버금가는 고급육으로서 명품브랜드화로 고부가가치를 얻을 수 있는 강점을 보유하고 있음.
¡ 제주흑우 번식과 관련하여 제주축산진흥원에서 ’92～’93년 제주도 전역을 수소문하여 늙은 제주흑우(연령 15～20세 이상)10마리를 수집하여 사육하기 시작하였으며 그 당시 난지농업연구소를 포함하여 23마리의 제주흑우가 사육되었고 사육 두수는 370여 마리에 불과함.
¡ 제주흑우를 보호하고 증식하기 위한 일환으로 제주도에서는 정책적으로 축산법에 근거하여 ‘제주흑우 보호 및 육성에 관한 조례’제정 (2006)으로 생축 및 정액과 수정란 등의 도외반출을 엄격히 제한하여 증식과 보호에 힘쓰고 있음.
¡ 2002년 8월에는 제주흑우를 우리나라 고유의 품종으로 인정하는 등록에 관한 규정이 마련 되어 2008년 10월에 등록우 96마리에 대한 등록 및 유전자원 조사가 이루어지는 등 고유 품종으로 인정받고 있고,동물유전자원관련 국제기구인 FAO에 제주흑우가 우리나라 한우 품종 4종 중 한개 품종으로 등록 신청됨 (농림축산식품부 보도자료,2010.6.16).
¡ 하지만 제주흑우 전 두수에 대한 유전분석체계가 이루어져 있지 않아 다른 한우와 구별할 유전검정 체계가 요구되며 증식된 개체 관리를 위해 유전등록시스템 구축이 시급함.
¡ 제주도 축산진흥원에서 2010년까지 1,000두,2015년까지 2,500두로 증산 계획하고 있으나, 제주흑우의 명품 브랜드화 사업의 시급성에 비추어 절대적으로 부족한 실정임.
¡ 또한 위 목표도,첨단 생명공학기술과 체내․외 수정란 이식 사업을 대대적으로 했을 경우 달성이 가능한 수치임.
¡ 제주흑우를 우수한 품종으로 개량하기 위해서는 종모우와 종빈우로 사용가능한 후보 선발이 시급하나,보유 개체 수가 적어 근친을 피하면서 대량 증식할 수 있는 시스템 구축에 애로가 있음.
¡ 제주흑우 사업은 중앙 정부의 농림부 차원에서 지원하고 산·학·연 사업으로 추진하여 체외수정,수정란 이식 기술 개선,체세포 핵이식 기술 도입,수정란 및 정자의 성 감별기술,수정란 동결 기술 개발 등의 첨단 생명공학기술 접목 및 산업화 브랜드화로 추진하는 것이 절실히 요구됨.
¡ 따라서 이러한 연구 사업의 성과로 체계적인 관리와 증식 기반이 마련된다면,제주흑우는 국내 유일의 품종으로 청정지역에서 생산된 고급육으로 blackcolor먹거리 웰빙고급육으로 대한민국을 대표하는 상품이 될 수 있을 것으로 기대됨.
제3절 연구개발의 범위
1. 제주흑우 수정란 생산 및 이식 체계 확립
- 체외수정란 생산 및 배양환경 기술 개발
- 체내수정란 생산 및 효율 조사
- 수정란 이식 및 임신 결과 분석
- 우수정액 생산 및 분석
- 제주흑우등록 및 관리
2. 성감별 정자 및 수정란 활용 기술 개발
- 제주흑우 정액의 성감별 및 인공 수정
- 제주흑우 수정란 성감별 기술 개발 및 도입
- 성감별 효율 조사
3. 제주흑우 수정란 동결 기술 개발 및 이식
- 체내·외 수정란 동결 기술의 최적화
- 복제수정란 동결 기술개발
- 현장이식 가능한 동결법 개발
4. 제주흑우 유전형질 검출 및 분석
- 제주흑우 고유 표지인자를 이용한 선발 체계 확립
- 제주흑우의 친자 감별 시스템 구축
- 제주흑우의 등록 및 계통도 조사
- 한우 및 타 품종과의 유전적 특이성 분석
5. 제주흑우 우수 유전형질 보존 및 응용기술개발
- 체세포핵이식 기술 최적화 및 복제수정란 생산 효율 개선
- 체세포복제수정란 이식 및 제주흑우 복제소 생산
- 줄기세포주 확립 기술 개발
제1절 연구개발 대상 기술의 국내․외 현황
1. 세계적 수준
- 기업화 단계 ◎
¡ 일본의 토종 소 화우 (와규)는 서양종과의 교배 100년 개량 역사를 통해 우수한 맛의 육질을 개발함.지방이 근육조직 내부까지 침착되어 표면에 균등하게 서리와 같이 덮여 있는 상강육과 육질의 섬세함은 다른 고기소의 추종을 불허해 세계적으로 널리 알려짐.
¡ 또한,일본은 30년 전부터 명품 소 브랜드화 (3대 유명 브랜드:요네자와,고베,마쓰사카)를 위해 체계적 육질 관리로 품질을 높이고 농가출하량을 조절해 가격을 유지하며 혈통과 유전자 관리로 명성을 유지하고자 노력함.
¡ 소 (와규)고유의 품질 유지 및 육종을 지속하기 위해 수정란이식 기술과 핵 이식기술을 적극 활용함.일본 농림수산성 통계에 의하면 2002년 기준으로 수정란 공란우 2만두,수란우5만 마리가 넘고,수태율이 50-55%,500억 원의 시장이 형성됨.
¡ 미국은 일본 화우를 이용하여 육우를 개량하고자 1997년과 1998년도 화우 송아지와 정액을 수입하였고,그 일부가 호주로 재수출되었음.이를 통해 뛰어난 육질을 자랑하는 와규브랜드가 미국에서 4개 이상,호주에서 11개 이상 등록됨.그 중 일부는 일본과 한국으로 수출됨.따라서 일본 내 화우 산업에 큰 영향을 미침.
¡ 현재 일본은 방사능 유출로 인한 방사능 오염소가 유통된 것이 밝혀짐에 따라 일본산 사육소의 소비가 위축되고 역으로 호주산 와규가 유통되고 있는 실정임.
2.국내수준
¡ 제주흑우는 ‘80년대 육량위주의 소 산업정책으로 멸종위기에 달하였으나 1992년부터 제우유전자원수집과 혈통관리를 통한 흑우 집단 증식과 함께 국제식량농업기구 (FAO)에 재래가축으로 등록하였고 (2004),제주특별자치도 특별법에 2차례에 걸친 제주흑우 보호 육성에 관한 조항 (제207조)과 관련 조례 재정(1993,2006)등 제도적인 제주흑우 보호 육성 체계를 구축해왔음.
¡ 국내 소 수정란 이식 기관은 56 개소이며,그 중 대부분은 한우 체외 수정란을 젖소에 이식하는 사업을 하고 있음.
¡ 현재 각 도종축원 등에서 체외 수정에 의한 수정란 사업에 의한 분만 성공률이 35-45%로, 외국 (일본)의 50-55%에 비추어 저조함.
¡ 또한 구제역으로 인한 피해를 줄이기 위한 노력으로 2010년부터 시작된 구제역 백신 투여는 더욱더 임신 및 분만율 저조를 가져옴
¡ 수정란의 체외 배양,성판별,동결 등의 기술은 전국 축산 관련 몇 몇 대학 등에서 지난 10여 년간 추진하여 확보되고 있으나,국내 축산업의 영세성으로 산업적 응용에는 도달 하지 못하고 있음.
¡ 특히 선진국에서 산업화 된 수정란 이식 기술은 더욱 빈약한 상태로서 단지 육종 기술로서 우수개체 선발 방법만이 실용화 되고 있는 실정임 (2004년 STEPI자료).
¡ 2012년 문화재청 주관 “천연기념물 지정 방안 연구 용역”에서 제주흑우는 다른 축종에 비해 관리가 잘 돼 천연기념물 지정 가능성이 제시됨.2차례의 현장 조사 및 심의를 통해 천연기념물 지정 신청 (2013년 3월 13일)이 이루어지고 가결 (2013년 4월 17일)되어 천연기념물 지정 예고 (2013년 5월 7일)가 이루어졌으며,마침내 2013년 6월 26일 최종심의를 통해 천연기념물로 지정되기로 결의되고 2013년 7월 22일 천연기념물 제546호로 지정되어 제주흑우 보호 및 육성에 박차를 가할 수 있는 계기가 마련됨.
제2절 관련기술 국내․외의 연구동향
1)국내 동향
¡ 이태훈 외,제주 흑우에서 다배란 처리 후 호르몬 수준과 혈액생화학치의 변화,한국수정란이식학회지 제21권 제3호.
¡ 제주발전연구원,일본 와규(和牛)성공사례와 제주흑우 명품화 방안,제주발전포럼.제26호(2008년).
¡ 김영훈,제주흑우 및 한우의 개량증식과 혈통보존,종축개량 제11권 제11호.통권69호 (2006.11).
¡ 조용일 외,제주 흑우 능력정보 수집 및 D/B구축,농촌진흥청,2006년.
¡ 이성수 외,제주흑우 체내수정란 농가보급 실증연구,농촌진흥청,2008년
¡ 문성호,제주흑우의 역사적 고찰과 현재,종축개량 제13권 제10호 통권92호
¡ 제주축산진흥원,재래흑우 육성시험(1993～1997)
¡ 제주축산진흥원,유전자 분석에 의한 한우와 흑우의 모색유전 연구(1997～)
¡ 제주축산진흥원,제주흑우의 번식특성 및 증식연구(1997～)
¡ 제주축산진흥원,흑우 생식세포 동결 및 이식연구(2000～)
¡ 제주축산진흥원,흑우 판별을 위한 모색 유전자형 설정(1999)
¡ 제주축산진흥원,흑우 유전자원 보존은행 설치(2000)
¡ 제주축산진흥원,생명공학 기법을 이용한 흑우 증식기술 확립(2001)
¡ 제주대학교 농과대학 동물과학연구소,한우의 개량체계와 제주흑우의 개량여건,동물과학논총 15(2000.12)
¡ 이성수,제주축산진흥원,제주흑우 육질특성 분석 및 평가에 관한 연구
¡ 김영훈 외,CIDR를 이용한 제주 한우 및 흑우의 체내 수정란 생산과 이식,한국수정란이식학회
¡ 한상현,제주흑우 육질관련 유전자 탐색에 관한 연구
2)국외관련
*제주흑우는 국내 제주에만 서식하는 유일한 자원이고 관련기술 연구 전무함.
제 3장 연구개발 수행 내용 및 결과
제1절 체외 수정란 배양 환경 기술 개발 및 최적화
1. 체외 배양환경 기술 개발
소 수정란의 체외배양 환경을 개선하기 위한 목적으로 체외 발달율을 높이고 질적 향상을 도모하기 위해 체외 배양 시 배양 첨가제 개발 및 처리 효과를 조사함.
i) 체외수정란 및 체세포핵이식 수정란배양에서 항산화제 Flavonoid 처리 효과를 조사함.
ii) 새로운 단백질 첨가제로서 배아줄기세포 생리활성물질의 이용 가능성을 조사함.
가. 체외수정란 발달에서 플라보노이드 첨가가 미치는 항산화·항사멸 작용
3,4-Hydroxyflavone Acts as an Antioxidant and Antiapoptotic Agent to Support Bovine Embryo Development In Vitro
앞서 체세포핵이식배아 발달 시 플라보노이드 첨가 효과를 바탕으로 플라보노이드 처리가 체외수정 배아의 발달에 미치는 영향을 조사함.
목적
소 체외수정 배아의 체외 배양 환경을 개선시켜 건강한 배아발생으로 임신율을 제고하기 위해 배양첨가제로서 강력한 항산화제인 플라보노이드의 이용가능성을 알아보고자 함.
실험 내용 및 결과
○ 체외수정 후 배양 2일째부터 2~4 세포기 배아의 체외배양액에 항산화 물질인 플라보노이드처리 효과를 조사하였음. 그리고 플라보노이드의 농도를 선별하고 그 영향을 조사하였음.
Table 3. Effect of 3,4-DHF on bovine embryo development in vitro (r=4)
표 3에서 나타낸 바와 같이, 배양 8일 째 배반포기배 발달율에서 10 uM 3,4-DHF 처리군의 결과가 1 uM 이나 50 uM 3,4-DHF 처리군의 결과와는 유의한 차이를 나타내지 않았지만 대조군에 비해 유의하게 높게 나타났으며 특히 100 uM 3,4-DHF 처리군과도 유의한 차이를 나타내어 용량 과다가 오히려 발달에 좋지 않다는 다른 연구자의 결과와 유사하게 나타났음 (Wang등, 2007).
이러한 결과는 배양 6일 째 상실배 발달율에서도 나타났는데, 10 uM 3,4-DHF 처리군의 결과가 가장 높은 발달율을 나타낸 반면 100 uM 3,4-DHF 처리군에서는 유의하게 낮은 발달율을 나타냄.
○ 대조군과 실험군의 체외 배양 8일째 발달된 배반포기배의 질적인 차이를 조사하기 위해 영양배엽세포와 내부세포괴 수를 동시에 검토할 수 있는 이중 염색을 실시하였음.
배반포기배의 세포수 조사는 다음과 같은 간편 이중염색방법을 통해 실시하였음. 1%triton X-100 (Sigma) 과 100 ug/ml propidium iodide (PI, Sigma)가 첨가된 TL-HEPES 용액에서 30초간 처리한 후 바로 25 mg/ml Hoechst 33258 (Sigma)가 첨가된 100% ethanol 용액에 넣어 4℃에서 다음날까지 정치시킴. 염색된 배반포기배는 glycerol로 세척하여 여분의 형광물질을 제거한 다음 슬라이드글라스에 올려 형광 현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)의 blue 필터 (excitation, 330~385 nm; emission, ≥ 420 nm) 하에서 관찰하여 내부세포괴와 영양외배엽 세포수를 분석하였음. 이때에 배반포의 내부세포괴는 파랗게 영양배엽세포는 빨갛게 염색되어 구분됨.
Table 4. Effect of SOD or 3,4-DHF on bovine embryo development in vitro (r=4)
그림 3. 체외발달 배아의 이중염색 결과; 대조군, 300U SOD처리군, 10 uM 3,4-DHF 처리군
각각의 처리군에서 발달된 배양 8일 째 배반포기배의 이중염색을 통한 세포수 조사 (그림 3 참조) 에서 10 uM 3,4-DHF 처리군의 세포수가 대조군과 300U SOD 처리군의 결과와 비교해 볼 때 유의한 증가 (표 3 참조) 를 나타냄. 특히 내부세포괴 수에서 유의한 증가를 나타냄.
○ 대조군과 실험군의 체외 배양 8일째 발달된 배반포기배의 질적인 차이를 조사하기 위해화-감작 형광 프루브를 이용하여 세포내 ROS (reactive oxygen species; 활성 산소종) 발현 유무와 H2O2 생성 정도를 조사함.
각 군에서 생성된 배반포기 배아를 5mM DCHFDA (dichlorodihydrofluorescein diacetate)에 20분간 반응시킨 다음 세척하여 형광현미경 필터 (excitation, 488nm; emission, 520 nm)하에서 조사하였음.
그림 4. 체외발달 배아의 ROS 분석 결과; 대조군, 300 U SOD처리군, 10 uM 3,4-DHF 처 리군, H2O2 생성율 (p<0.05)
각각의 처리군에서 발달된 배양 8일 째 배반포기배의 ROS 발현율 조사 (그림 4 참조)에서 10 uM 3,4-DHF 처리군에서 배양된 배반포기배의 ROS 생성율이 대조군과 300U SOD 처리군의 결과와 비교해 볼 때 유의하게 감소하는 것으로 확인됨. 따라서 플라보노이드 처리는 강력한 항산화제로서 ROS 감소에 효과가 있음을 확인하였음.
○ 플라보노이드 처리가 배아의 세포사멸에 미치는 영향을 조사하기 위하여 TUNEL 분석을 실시하였음.
분석을 위해 회수된 대조군과 실험군의 배반포기배는 1mg/ml polyvinylpyrolidone가 들어있는 PBS (처리용액) 에 3번 세척하고 3.7% paraformaldehyde 에 1시간 동안 실온에서 고정을 실시함. 고정된 배아는 처리용액으로 다시 세척하고 0.3% Triton X-100 용액으로 실온에서 1시간동안 침투시킴. 배아는 다시 처리용액으로 2회 세척한 다음, 광을 차단시킨 채로 37℃ 배양기에서 형광물질이 부착된 dUTP 와 terminal deoxynucleo tidyl 전환 효소 (Roche,Mannheim, Germany) 에 1시간 동안 반응을 유도하고, 40 mg/ml propidium iodide (PI,Sigma) 와 50 mg/ml RNase A 용액에 넣어 1시간동안 핵 염색함.
그림 5. 체외발달 배아의 TUNEL분석 결과; 대조군, 300 U SOD처리군, 10 uM 3,4-DHF처리군, 총세포수에 대한 세포 사멸율 (p<0.05)
체외배양 환경이 배아의 사멸에 미치는 영향을 조사하기 위해 각 군의 배양 8일 째 발달된 배반포기 배를 각각 TUNEL 분석을 실시하였던 바, 세포 사멸율 (apoptotic index) 은 대조군 (6.87±4.3%) 에 비하여 10 uM 플라보노이드 처리군 (2.96±2.4%) 에서 현저히 감소하는 것을 알 수 있었음 (그림 5 참조). 이러한 결과는 체외배양 환경에 플라보노이드 처리가 세포 사멸을 유의하게 감소시킴을 나타냄. 이는 SOD 처리보다 효과가 있음을 확인함.
○ Real-time PCR (polymerase chain reaction) 을 이용하여 체외발달 배아의 유전자 발현을 조사함.
그림 6. Real-time RT-PCR을 이용한 항산화제 처리 후 체외발달 배아의 유전자 발현 조사
항산화제가 첨가된 체외 배양 환경이 유전자 발현에 미치는 영향을 조사하였던바, 대조군에 비하여 항산화 효과 (SOX ↓, Mn-SOD↑), 세포사멸 감소 (Caspase-3 ↓, Bax ↓,Survivin ↑, Bax inhibitor ↑), 대사율 증가 (Glut-5↑), 착상율 증가(In-tau↑) 와 관련된 유전자들의 발현이 10 uM 플라보노이드 처리군에서 가장 유의하게 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었음 (그림 6 참조).
○ 배양기내 조절된 산소농도와 플라보노이드 처리가 소 체외 수정란 발달에 미치는 영향일반적으로 배양기내의 산소농도는 대략 20% 정도인데, 질소농도를 높여 산소농도를 5%로 줄였을 때와 여기에 10 uM 플라보노이드 처리에 따른 ROS 감소효과가 배발달에 미치는 영향을 더불어 조사하였음.
산소농도가 높은 (20%) 배양기 환경 보다 산소농도가 낮은 (5%) 배양기 환경에서 성장한 배아가 유의하게 높은 배반포기배 형성율을 나타냈으며, 여기에 플라보노이드를 처리하였을 때 더욱 더 좋은 배아 발생을 유도할 수 있음을 확인하였음. 또한 이러한 효과는 세포수 조사에서도 확인되었던 바, 총세포수 증가 뿐만 아니라 내부세포괴수 증가로 이어져 건강한 배아 생성에 낮은 산소농도환경 및 산소종 형성 억제가 효과가 있음을 확인하였음 (표 5 참조).
따라서, 5% 산소농도 배양환경 조건하에서 배양액내에 10 uM 플라보노이드 첨가하는 배양조건은 소 체외수정란 유래 배반포기배 발달율 증가, 총 세포수 및 내부세포괴 수 증가, 활성 산소종 생성 감소, 세포사멸율 감소, 발달 유용유전자 발현율 증가등의 효과를 나타내어 흑우 체외수정란 생산 및 체세포핵이식 복제수정란 발생에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대됨.
*이상의 내용은 Journal of Reproduction and Development 2011 Vol. 57 127~134에 게재됨.